mRNA Synthesis by In Vitro Transcription

VectorBuilder는 최대 10kb 길이의 커스텀 mRNA에 대한 in vitro transcription 기반 mRNA 합성 서비스를 제공하며, 이는 in vitro translation, 생화학 연구, 세포 또는 배아에 주입 후 단백질 발현, 백신 개발을 포함한 다양한 다운스트림 응용 분야에 적합하다.

mRNA 합성 프로세스는 당사의 벡터 클로닝 서비스에 사용되는 독점적인 in vitro transcription벡터를 활용하여 고품질 mRNA를 생산하도록 고도로 최적화되어 있다. 또한 고객이 제공한 벡터에서 mRNA를 합성할 수도 있다. Research-grade mRNA 합성 서비스는 초기 개발 연구에 적합하고, 임상 적용을 위한 GMP-grade mRNA 합성 서비스도 제공한다. mRNA 외에도 CRISPR/Cas9 타겟팅을 위한 gRNA 및 짧은 RNA를 필요로 하는 응용 분야를 위한 기타 small RNA를 포함한 small RNA를 생성할 수 있다.

Types of RNAs offered
  • mRNAs of up to >10 kb in length
  • gRNAs for CRISPR applications
  • Other short RNAs of defined sequences (microRNA, siRNA etc.)

Service Details

Highlights
  • Bacteriophage 유래 T7 RNA polymerase (RNAP)를 기반으로 하는 고효율, 다용도  in vitro transcription 접근법 활용
  • mRNA 안정성을 높이고 효율적인 단백질 translation을 촉진하기 위해 transcripts에 5’ m7G-cap and 3’ polyA tails 추가
  • 선천적 면역 반응을 조절하기 위한 변형된 nucleotides의 추가를 포함한 다양한 RNA modification 옵션
  • DNA template 및 terminal 5’ triphosphates를 각각 제거하기 용이하게 하는 Post-transcriptional DNase및 phosphatase 처리
  • Silica gel 정제 및 magnetic bead기반 정제를 포함한 다양한 RNA purification 옵션
Price and turnaround
Scale Application Deliverable Price Turnaround
>500 ng/ul Molecular biology, cell culture, and in vivo use 25 ul, nuclease-free water, sterile $399 2-4 days
50-200 ug 100 ul, nuclease-free water, sterile Please inquire Please inquire
0.25-1 mg 500 ul, nuclease-free water, sterile

* mRNA transcription 서비스의 경우 기본적으로 5' m7G-cap 및 3' polyA tail이 추가되지만, 다른 RNA modification을 요청할 경우 추가 비용이 발생할 수 있다. 사용 가능한 RNA modification 옵션에 대해 문의하려면 디자인 의뢰하기를 보내주세요. 

Customers-supplied materials

고객이 제공하는 벡터가 필요한 경우 "서포트" > "시료 제출 양식"에 시료 정보를 제출해 주세요. 시료의 지연이나 손상을 방지하기 위해, 당사의 가이드라인을 엄격히 준수해 주시기 바랍니다. 고객이 제공한 모든 시료는 VectorBuilder의 필수 QC를 거치며, 시료의 타입이나 용도에 따라 시료당 $120부터 추가 QC 요금이 발생할 수 있다. 고객 제공 시료가 QC를 통과할 때까지 생산을 시작할 수 없다.

Shipping and storage

mRNA는 nuclease-free water에 보관되고 드라이아이스로 배송된다. 수령 즉시 mRNA 샘플은 장기 보관을 위해 (최소 6개월 동안 안정) -80°C에서 보관해야 하며, 1주일 이내에 사용시에는 -20°C에 보관할 수 있다. mRNA의 유통기한은 약 1년이다. mRNA의 반복적인 동결-융해는 심각한 RNA 분해를 일으킬 수 있으므로 피해야 한다.

Technical Information

mRNA production process and QC

mRNA 생산을 위해 적절한 반응 조건과 nucleotide triphosphates의 존재 하에 bacteriophage T7 RNAP에 의한 mRNA의 고효율 생산을 촉진하기 위해 목적 DNA 템플릿 서열의 상류에 T7 promoter를 활용하는 in vitro transcription 방법을 사용한다. T7 RNAP는 매우 강력한 효소로 이 효소를 사용한 transcription 반응은 몇 시간 내에 많은 양의 기능성 RNA를 생산할 수 있다. 당사의 일반적인 mRNA 생산 워크플로우는 템플릿 DNA 서열을 디자인하고 합성한 후, in vitro transcription 벡터에 클로닝하는 것으로 시작한다. 이후에 plasmid DNA는 정제, 검증 및 선형화한 후, in vitro transcription 반응으로 원하는 transcript가 생성된다.  그런 다음 mRNA는 기본 정제 과정인 silica gel purification으로 정제된다. 별도 요청 시 magnetic-bead purification으로 mRNA를 정제할 수도 있다.

Figure 1. Typical workflow of mRNA synthesis by in vitro transcription.

VectorBuilder에서 생산된 모든 mRNA는 엄격한 품질 관리를 거치며, 오염 물질이 없고 디자인한 대로 정확한 서열을 포함한다. 여기에는 1) restriction digestion 분석 및 Sanger sequencing에 의한 클로닝된 DNA 템플릿 서열을 포함하는 in vitro transcription vector의 검증; 2) 전사체의 크기에 따라 denaturing PAGE 또는 agarose gel electrophoresis에 의한 합성된 RNA의 최종 QC가 포함된다.

How to Order

Order both vector cloning and RNA preparation
Order RNA preparation from your own vector

FAQ

What are the advantages of in vitro transcription-based RNA synthesis over chemical synthesis of RNA?

Producing RNAs by in vitro transcription offers several advantages over chemical synthesis which include:

1) Cost-effectiveness and technical simplicity – Chemical synthesis of RNA is typically performed by automated solid-phase oligonucleotide synthesis utilizing phosphoramidite chemistry, which involves several cycles of specific synthesis steps making the process technically complex and expensive. In vitro transcription-based RNA synthesis on the other hand is a highly versatile, yet simple and cost-effective technique routinely used by many laboratories to generate a variety of transcripts.

2) Higher yields – In vitro transcription based-RNA synthesis typically utilizes the bacteriophage derived T7 RNAP for generating desired RNA transcripts from DNA template sequences located downstream of a T7 promoter. The T7 RNAP is a robust enzyme with significantly high processivity and frequency, allowing milligrams of mRNA to be synthesized from very small reaction volumes, thereby making this process highly scalable.

3) Flexibility - In vitro transcription allows synthesis of RNAs ranging in length from a few hundred nucleotides to more than 10 kilobases which can be used for a variety of downstream applications, whereas chemical synthesis allows RNAs of only up to 200 bases to be synthesized, with longer sequences being highly prone to errors.

What makes mRNAs attractive candidates for vaccine therapy?

mRNAs have recently emerged as promising candidates in the field of vaccine development as they offer several advantages over traditional virus or DNA-based vaccines including:

1) Efficacy - mRNA vaccines have been shown to be highly effective in mounting reliable immune response without any significant side effects.

2) Ease of delivery - Formulating mRNA vaccines into carrier molecules allows them to be efficiently delivered into host cells, followed by their rapid uptake and expression in the cytoplasm without having to cross the nuclear membrane. Moreover, they can be easily administered via various routes including subcutaneous, intranodal, intradermal, intramuscular or intravenous injections which play a critical role in determining the how safe and effective the vaccine will be.

3) Safety - mRNA vaccines are non-infectious and non-integrating without any associated risks of insertional mutagenesis which makes them extremely safe compared to viral vector-based vaccines. Additionally, their safety profile can be further improved by the incorporation of modified nucleotides that can modulate innate immune response upon delivery to host cells.

4) Production ease and scalability - mRNA vaccines can be produced very rapidly at relatively low costs and at large scales utilizing the in vitro transcription approach which is technically far less challenging than producing virus-based vaccines. Moreover, since mRNA vaccines allow antigens to be synthesized in situ, this eliminates the need for protein purification and stabilization which can be hard to achieve for certain antigens. The relative ease of production enables mRNA vaccine candidates to be rapidly translated from the early discovery phase to the clinical and commercial phases in response to epidemics.

5) Versatility - mRNA offers a highly versatile platform for vaccine development since it can be used for simultaneous expression of multiple viral antigens using a single vaccine, which is typically harder to achieve with other conventional vaccine types.