In Vitro Transcription에 의한 mRNA 합성

VectorBuilder는 최대 10kb 이상의 길이를 갖는 커스텀 mRNA에 대한 in vitro transcription 기반 mRNA 합성 서비스를 제공하며, 이는 in vitro translation, 생화학 연구, 세포 또는 배아에 주입 후 단백질 발현, 백신 개발을 포함한 다양한 응용 분야에 사용될 수 있습니다.

mRNA 합성 프로세스는 당사의 벡터 클로닝 서비스에 사용되는 자체적인 in vitro transcription 벡터를 사용하여 고품질 mRNA를 생산하도록 고도로 최적화되어 있습니다. 또한 고객이 제공한 벡터에서 mRNA를 합성할 수도 있습니다. Research-grade mRNA 합성 서비스는 초기 개발 연구에 적합하며, 임상에 적용하기 위한 GMP-grade mRNA 합성 서비스도 제공합니다. mRNA 이외에도 CRISPR/Cas9 타겟팅을 위한 gRNA나 짧은 RNA가 필요한 응용 분야들을 위한 여러 가지 small RNA를 생성할 수 있습니다.

제공되는 RNA의 유형
  • >10 kb 의 길이를 가진 mRNA
  • CRISPR와 함께 사용할 gRNA
  • microRNA, siRNA와 같이 특정한 서열을 가진 짧은 RNA

서비스 세부 사항

서비스 중점 사항
  • Bacteriophage에서 유래된 T7 RNA polymerase (RNAP)를 기반으로 하는 고효율, 다양성을 제공하는 in vitro transcription 방법을 사용합니다.
  • mRNA 안정성을 높이고 효율적인 단백질 translation을 촉진하기 위해 transcripts에 5’ m7G-cap과 3’ polyA tail을 추가합니다.
  • Template plasmid에 ployA tract를 도입하여 110 bp의 긴 polyA tail을 가진 mRNA를 생성할 수 있습니다.
  • 선천 면역 (innate immunity) 반응을 조절하기 위한 변형된 염기 추가 등을 포함한 다양한 RNA 변형 옵션들이 있습니다.
  • Transcription 반응 후에 남아 있는 DNA template와 terminal 5’ triphosphates를 제거하기 위하여 DNase와 phosphatase를 처리합니다.
  • Silica gel과 magnetic bead 기반의 정제를 포함하는 다양한 RNA 정제 옵션들을 제공합니다.
가격 및 소요시간
Scale Application Deliverable Price Turnaround
>500 ng/ul 분자생물학, 세포 배양 및 in vivo 사용 25 ul, nuclease-free water, sterile $399* 2-4 일
50-200 ug 100 ul, nuclease-free water, sterile 문의해주시기 바랍니다. 문의해주시기 바랍니다.
0.25-1 mg 500 ul, nuclease-free water, sterile

* 이 가격은 mRNA 제조만을 위한 가격이며, 벡터 클로닝 가격은 별도입니다. mRNA transcription 서비스의 경우 기본적으로 5' m7G-cap 및 3' polyA tail이 부가되지만, 다른 RNA 변형을 요청할 경우 추가 비용이 발생할 수 있습니다. 또한 cap 0가 기본적으로 mRNA에 부가되며, 요청에 따라 cap 1이 포함된 RNA도 제공해드릴 수 있습니다. 제공 가능한 RNA 변형 옵션에 대해 문의하시려면 디자인 의뢰하기를 통하여 문의해주시기 바랍니다.

고객이 제공하는 시료

고객이 제공하는 벡터가 필요한 경우 "서포트" > "시료 제출 양식"에 따라서 벡터를 보내주시기 바랍니다. 배송 지연이나 시료 손상을 방지하기 위해 당사의 가이드라인을 엄격히 따라 주시기 바랍니다. 모든 고객이 제공하는 시료는 VectorBuilder에 의해 의무적으로 QC를 거치며, 시료의 타입이나 용도에 따라 시료당 $120이상의 추가 QC 요금이 부과될 수 있습니다. 고객이 제공한 시료가 QC를 통과할 때까지는 생산을 시작할 수 없음을 유의하시기 바랍니다.

배송 및 보관

mRNA는 nuclease-free water에 녹인 후 얼려서 드라이아이스와 함께 배송됩니다. 수령 즉시 mRNA 샘플은 장기 보관을 위해 (최소 6개월 이상 안정) -80°C에서 보관해야 하며, 1주일 이내에 사용시에는 -20°C에 보관해야 합니다. mRNA의 유통기한은 약 1년입니다. mRNA의 반복적인 동결-융해는 심각한 RNA 분해를 일으킬 수 있으므로 피해야 합니다. 

기술적인 정보

mRNA 제조 과정 및 QC

mRNA 생산을 위해 적절한 반응 조건과 nucleotide triphosphates의 존재 하에 bacteriophage T7 RNAP에 의한 mRNA의 고효율 생산을 촉진하기 위해 DNA template 서열의 upstream에 있는 T7 promoter를 사용하는 in vitro transcription 방법을 사용합니다. T7 RNAP는 매우 강력한 효소로 이 효소를 사용한 transcription 반응은 몇 시간 내에 많은 양의 활성을 지닌 RNA를 생산할 수 있습니다. 당사의 일반적인 mRNA 생산 워크플로우는 template DNA 서열을 디자인하고 합성한 후, in vitro transcription 벡터에 클로닝하는 것으로 시작합니다. 이후에 plasmid DNA는 정제, 검증, 선형화 단계를 거쳐, in vitro transcription 반응에 사용되어 원하는 transcript가 생성됩니다. 그런 다음 mRNA는 기본 정제 과정인 silica gel을 사용하여 정제됩니다. 별도 요청 시 magnetic-bead를 사용하여 mRNA를 정제할 수도 있습니다.

Figure 1. In vitro transcription에 의하여 mRNA를 합성하는 일반적인 워크플로우.

VectorBuilder에서 생산된 모든 mRNA는 오염 물질이 없고 디자인한 대로 정확한 서열을 포함하는지를 확인하기 위한 엄격한 품질 관리를 거칩니다. 여기에는 1) 제한효소 절단 분석 방법 및 Sanger sequencing에 의한 클로닝된 in vitro transcription 벡터의 DNA template 검증; 2) denaturing PAGE 또는 agarose gel electrophoresis에 의하여 합성된 RNA의 길이를 확인하는 최종 QC가 포함됩니다.

실험에 의한 검증

당사의 in vitro transcription 기반의 mRNA 제조 과정은 mRNA의 안정성을 향상시키고 효율적인 단백질 생산을 할 수 있도록 고도로 최적화 되어 왔습니다.아래의 Figure 2에는 in vitro transcription 벡터에 의하여 생산된 mRNA에서 성공적으로 단백질의 translation이 일어나고 있음을 보여주고 있습니다.

Figure 2. 293T 세포들이 5' cap 1 구조를 가진 EGFP mRNA로 transfection되었습니다. 이미지들은 transfection 48시간 후에 모습을 보여 주고 있습니다. (100x 확대, 왼쪽: bright field, 오른쪽: EGFP)

주문 방법

벡터 클로닝과 RNA 제조를 함께 주문하는 경우
고객의 벡터를 이용한 RNA 제조를 주문하는 경우

자주 묻는 질문

화학적 방법에 의한 RNA 합성과 비교할 때 in vitro transcription 기반의 RNA 합성이 갖는 장점이 무엇입니까?

In vitro transcription에 의한 RNA 합성은 화학적 합성에 비해 다음과 같은 여러 가지의 유리한 점들이 있습니다:

1) 비용 효율성 및 기술적 간편성 – RNA의 화학 합성은 일반적으로 phosphoramidite chemistry를 이용하는 automated solid-phase oligonucleotide 합성법에 의합니다. 이 때 이용되는 여러 cycle의 합성법은 기술적으로 복잡하고 비용이 많이 드는 단점이 있습니다. 반면에 in vitro transcription 기반의 RNA 합성법은 다양성을 제공하면서도 기술적으로 더 단순하며 비용적인 면에서도 효율적이기 때문에 많은 연구실들에서 다양한 transcript를 만들 때 일반적으로 많이 이용되는 방법입니다.

2) 높은 수율 – In vitro transcription 기반의 RNA 합성은 일반적으로 bacteriophage 유래의 T7 RNAP을 사용하여 T7 promoter downstream에 있는 DNA template로부터 원하는 RNA transcript를 만듭니다. T7 RNAP는 강력한 효소로 빠른 속도와 빈도로 transcription이 일어나게 하는 특성이 있어서 작은 부피의 반응에서도 mg 수준의 mRNA를 얻을 수 있기 때문에 제조 규모를 쉽게 확장할 수 있습니다.

3) 유연성 - In vitro transcription에 의하면 다양한 용도를 위한 수백 ~ 수만 base의 길이를 가진 RNA를 합성할 수 있습니다. 반면에, 화학 합성법은 200 base 정도까지만 합성이 가능하며, 길이가 길어질수록 변이가 생길 가능성도 커집니다.

백신 치료를 위한 후보 물질로 mRNA가 주목받는 이유가 무엇입니까?

mRNAs는 기존의 바이러스와 DNA 백신에 비하여 다음과 같은 여러 장점들이 있기 때문에 최근에 백신 개발을 위한 유망한 후보 물질로 등장하고 있습니다:

1) 효능 - mRNA 백신은 심각한 부작용이 없이 확실한 면역 반응을 증가시킬 수 있음을 보여왔습니다.

2) 전달의 용이성 - mRNA 백신을 carrier와 formulation하는 경우 세포 내로 효율적으로 전달이 되고, 이어서 세포핵막을 통과할 필요 없이 세포질 내에서 빠른 발현이 일어납니다. 또한 투여 방법도 피하, 신장, 피부, 근육, 정맥 등의 여러 경로가 가능하기 때문에 백신의 안전성과 효능을 시험하는데 매우 중요한 역할을 하는 물질입니다.

3) 안전성 - mRNA 백신은 감염이 되거나 세포의 유전체 내로 삽입되지 않기 때문에 이에 따른 변이가 일어날 가능성이 거의 없어서 바이러스 벡터기반의 백신에 비하여 매우 안전합니다. 또한 변형된 염기를 도입하여 선천 면역 반응을 조절할 수 있기 때문에 세포 내로 전달하였을 때의 안전성을 더욱 향상시킬 수 있습니다.

4) 생산의 용이성 및 확장성 - mRNA 백신은 바이러스 기반의 백신에 비하여 기술적으로 훨씬 용이한 in vitro transcription 방법에 의하여 생산되기 때문에 상대적으로 적은 비용으로 빠른 대량 생산이 가능합니다. 또한 생체 내에서 항원이 만들어지게 하기 때문에 항원에 따른 어려움이 있는 단백질 정제와 안정화가 필요 없습니다. 상대적인 생산 용이성은 감염병이 유행하는 경우 초기의 발견 단계에서 임상과 제품 생산 단계로의 빠른 전환이 가능하도록 해줍니다.

5) 다양성 - mRNA 백신은 기존의 백신들로는 하기 어려운, 단일 백신으로 여러 바이러스의 항원들을 동시에 발현하는 것이 가능하기 때문에 백신 개발에 있어 플랫폼의 다양성을 제공해줍니다.