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AAV는 광범위한 조직 친화성 (tropism), 장기간 지속되는 유전자 발현, 그리고 낮은 면역원성으로 인해 유전자 치료제 및 백신 개발에 널리 사용되고 있습니다. 그러나 기존 serotype들은 불충분한 조직 특이성, 오프타겟 (off-target) transduction가능성과 낮은 유전자 전달 효율, 기존 중화항체 (pre-existing neutralizing antibodies)의 존재, 그리고 제조상의 어려움 등 여러 한계를 가지고 있습니다. VectorBuilder의 캡시드 엔지니어링 (capsid engineering) 플랫폼은 고객의 치료제 개발 목표에 부합하도록 향상된 특성을 지닌 신규 AAV 변이체 (variants )를 가장 효과적이고 효율적으로 개발할 수 있는 솔루션을 제공합니다.
통합 서비스 플랫폼
벡터 디자인부터 GMP 제조에 이르기까지 AAV 전임상 및 임상 단계의 모든 요구사항을 충족하는 세계 유일의 원스톱 솔루션.
최적화된 library 설계
VectorBuilder의 전문성을 바탕으로 최적의 복잡도 (complexity)를 가진 library를 설계하고, 다양한 접근 방식을 통해 커스텀 capsid library를 제작.
고품질 library 패키징
VectorBuilder의 독자적인 패키징 플랫폼을 활용하여 각 바이러스 입자가 해당 캡시드 변이체 (matching capsid variant)를 탑재하고 높은 역가 (titer)를 달성.
강력한 스크리닝 역량
AAALAC 인증 시설에서 수행되는 마우스, 랫트 및 NHP를 포함하여, 강력하고 신뢰성 높은 In vitro 및 In vivo 스크리닝 서비스를 제공.
AAV capsid library를 제작 및 스크리닝을 통해 1) 특정 조직 또는 장기 내 표적 세포로의 효율적인 transduction, 2) 세포 유형 특이적 수용체에 대한 높은 결합 친화력 (high affinity), 또는 3) 중화 항체 (neutralizing antibodies) 회피 등 높은 치료 잠재력을 가진 후보 물질을 발굴할 수 있습니다. AAV 캡시드 진화 (capsid evolution)의 일반적인 워크플로우는 아래와 같습니다.
아래는 다양한 AAV capsid 변이체 (variant)를 생성하기 위한 일반적인 전략들입니다. 이후, capsid library는 이러한 변이체들을 AAV 벡터에 대규모 병렬 클로닝 (parallel cloning)하여 제작되며, 이를 통해 각각 rep 유전자와 capsid 유전자 변이체를 포함하는 키메라 AAV 게놈 (chimeric AAV genomes)이 형성됩니다.
랜덤 펩타이드 디스플레이 (Random Peptide Display)
랜덤 펩타이드 디스플레이 (Random Peptide Display)는 일반적으로 7~9개의 아미노산으로 구성된 랜덤 펩타이드 서열을 AAV capsid의 특정 부위에 삽입하는 기술로, 바이러스의 자연적인 세포 상호작용을 변화시키고 특정 세포 수용체로 재표적화 (retarget) 합니다. 펩타이드는 일반적으로, 펩타이드의 표면 노출 (surface exposure)을 촉진하고 바이러스-호스트 상호작용에 중요한 AAV capsid의 위치에 삽입됩니다. 예를 들어, AAV2 capsid의 587번과 588번 위치 사이 (variable region VRIII 내)는 대부분의 AAV2 기반 펩타이드 디스플레이 library에서 선호되는 삽입 부위입니다. 이 위치에 펩타이드를 삽입하면 AAV2의 주요 수용체인 heparan sulfate proteoglycan (HSPG) 모티프 (motif)가 제거되어, 디스플레이된 펩타이드가 세포 표면 분자와 효율적으로 상호작용할 수 있게 됩니다.
오류 유발 PCR (Error-prone PCR)
오류 유발 PCR (Error-prone PCR)은 고도의 다양성을 가진 AAV capsid library를 개발하는 가장 간단한 방법으로, 표준 PCR 방법을 변형하여 AAV capsid 유전자에 돌연변이를 유발하는 방식입니다. 구체적으로, error-prone PCR은 AAV capsid 유전자에 랜덤 점 돌연변이 (random point mutations)를 도입하기 위해, 낮은 정확도의 polymerase, 긴 연장 (extension) 시간, 높은 Mg2+ 농도, Mn2+ 첨가, 다양한 dNTP 농도 등 다양한 비최적 (sub-optimal) PCR 조건들을 조합하여 사용합니다.
DNA 패밀리 셔플링 (DNA Family Shuffling)
DNA 패밀리 셔플링 (DNA Family Shuffling)은 서로 다른 AAV serotype에서 유래한 모체 (parental) capsid 유전자를 분자적으로 교배 (molecular interbreeding)하여 키메라 AAV 캡시드 (chimeric AAV capsid)를 생성하는 매우 효율적인 방법입니다. 이를 위해 다양한 AAV serotype의 모체 캡시드 유전자를 단편화 (fragmentation)한 후, 부분적인 서열 상동성 (partial sequence homology)에 기반하여 유전자를 재조합하는 프라이머 없는 PCR (primer-less PCR)을 통해 새로운 전장 (full-length) 캡시드 변이체를 재조립합니다. 대안적인 전략으로, 합성 셔플링 (synthetic shuffling)을 통해 고복잡도 library를 생성할 수도 있습니다. 이 방법은 합리적 설계 (rational design) (AAV 생물학에 대한 사전 지식을 바탕으로 캡시드를 변형)와 방향성 진화 (directed evolution)를 결합합니다. 이 접근법에서는 자연적으로 발생하는 AAV serotype의 상세한 구조 및 서열 분석을 기반으로 돌연변이 유발에 적합한 캡시드 위치를 먼저 식별하고 평가합니다. 그 후, 돌연변이를 포함하는 단편을 합성하고 조립하여 새로운 전장 캡시드 변이체를 완성합니다.
인실리코 설계 (In silico design)
AAV capsid library의 인실리코 (in silico) 설계는 AAV의 성능을 향상시킬 잠재력이 있는 capsid 변이 서열을 컴퓨터로 예측하기 위해 다양한 접근법을 활용합니다. 일반적으로 사용되는 방법 중 하나는 조상 서열 재구성 (ancestral reconstruction)으로, 가상의 조상 AAV library를 in silico 로 설계한 후, 실험적 검증을 통해 향상된 조직 친화성 (tropism)을 가진 고효능 조상 capsid 서열을 찾아내는 과정을 포함합니다. 이 접근법의 근거는 자연선택 과정에서 살아남아 출현한 진화적 AAV 중간체 (evolutionary AAV intermediates)가 바이러스의 구조와 기능을 유지하면서도 고유한 특성을 보유하고 있을 가능성이 높다는 것입니다. 머신 러닝 (machine learning)은 또 다른 일반적인 in silico 설계 방식으로, 컴퓨터 알고리즘을 적용하여 가상의 capsid 변이체로부터 생존 가능한 바이러스가 생산될 확률을 예측합니다. 머신 러닝 알고리즘은 가용한 입력 데이터에 크게 의존하여 단백질의 구조-기능 관계를 학습하며, 이를 바탕으로 바이러스 캡시드 조립 (viral capsid assembly)과 같은 복잡한 생리학적 과정의 결과를 예측합니다.
고객의 신규 AAV capsid는 목표로 하는 특성을 갖추었는지 확인하기 위해 철저한 특성 분석 (characterization) 및 검증 과정을 거치게 됩니다. 여기에는 예를 들어, 조직 친화성 (tissue tropism), transduction 효율, 그리고 잠재적인 오프 타겟 효과 (off-target effect)를 평가하기 위해, 다양한 동물 종 (species)을 대상으로 수행하는 AAV 생체내 분포 분석 (AAV biodistribution profiling) 이 포함될 수 있습니다. 또한, VectorBuilder의 CliniVec™ 컨설팅 서비스를 활용하여 AAV 전달 벡터 (transfer vector)와 패키징 벡터를 동시 최적화 (concurrent optimizations)함으로써, 치료제 개발의 성공 잠재력을 극대화할 수 있는 솔루션을 제공합니다.
Figure 1. (NNK)11 펩타이드 디스플레이 AAV capsid plasmid library의 nucleotide 조성. 이 library는 NNK degenerated codon 전략을 사용하여 제작되었습니다. 각 막대는 DNA 서열 상의 개별 nucleotide 위치를 나타내며, 컬러는 관찰된 nucleotide를 표시합니다. 모든 위치에서 예상되는 nucleotide가 관찰되었으며, 관찰 빈도는 이론값에 근접했습니다 (N = 25% A + 25% T + 25% G + 25% C, K = 50% T + 50% G).
Figure 2. 펩타이드 디스플레이 AAV capsid plasmid library의 7-mer 가변 (variable) 영역 내 아미노산 분포. 이 library는 NNK degenerate codon 전략을 사용하여 제작되었습니다. 각 막대는 특정 아미노산 또는 stop codon의 이론적 비율 (청록색) 또는 실제 비율 (분홍색)을 나타냅니다. 20가지 모든 아미노산 및 stop codon의 관찰된 빈도는 이론적 빈도와 거의 일치하였습니다.
Figure 3. 서로 다른 플랫폼을 사용하여 동일한 AAV capsid library를 두 기술적 반복 (technical replicates) 실험 간 바이러스 패키징 재현성 비교 (왼쪽: VB 자체 개발 플랫폼; 오른쪽: 기존 플랫폼). VB 자체 개발 플랫폼을 사용했을 때는 반복 실험군 간에 강한 상관관계 (r = 0.70)가 관찰되었으며, 이는 높은 재현성을 의미합니다. 반면, 기존 패키징 방법은 낮은 상관관계 (r = 0.02)를 보였는데, 이는 패키징 과정 중 효율을 저하시키는 확률적 사건 (stochastic events)이 발생했기 때문인 것으로 보입니다.
Figure 4. 동물 개체 간 in vivo AAV capsid library 스크리닝 결과값 (readouts)의 높은 상관관계. (A) AAV capsid library를 망막하 (subretinally) 주사한 후, RNA-seq을 수행하였습니다. 서로 다른 마우스의 망막에서 확인된 변이체들의 리드 수 (read counts)를 비교한 결과, 강한 상관관계 (r = 0.88)를 보였습니다. (B) AAV capsid library를 꼬리 정맥 (tail vein) 주사한 후, DNA-seq을 수행하였습니다. 서로 다른 마우스의 간 (liver)에서 확인된 리드 수를 비교한 결과, 강한 상관관계 (r = 0.93)가 입증되었습니다. 이러한 결과들은 VectorBuilder의 in vivo 스크리닝 플랫폼이 신규 AAV capsid 발굴에 있어 매우 높은 신뢰성을 가지고 있음을 보여줍니다.
VectorBuilder의 혁신적인 capsid 기술은 강력한 솔루션을 제공합니다. 향상된 표적 특이성 (targeting specificity)과 극대화된 유전자 전달 성능을 갖춘 엔지니어링 캡시드 (engineered capsids)를 통해 더욱 안전하고 효과적이며 효율적인 AAV 기반 치료제의 개발을 구현할 수 있습니다.
뇌 (brain)
뇌혈관장벽 (blood-brain barrier)을 효과적으로 통과하여 최대 효율로 전달하도록 최적화되었습니다.
안과 (Ocular)
VectorBuilder의 안과용 capsid는 탁월한 망막 전체 침투력 (pan-retinal penetration)과 주변부 확산능 (peripheral spread)을 자랑하며, 특히 망막색소상피 (RPE)에서 우수한 transduction 효율을 나타냅니다.
근육 (Muscular)
VectorBuilder의 신규 capsid는 골격근 (skeletal), 심장근 (cardiac), 그리고 횡격막 (diaphragm) 근육에 대한 표적화 및 효율성을 현저히 향상시킵니다.
| Method | Description | Advantages | Limitations |
|---|---|---|---|
| Random Peptide Display | Insertion of random peptide sequences of usually 7 to 9 amino acids into specific sites of the AAV capsid. |
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Potential immunogenicity concerns |
| Error-Prone PCR | Employs sub-optimal PCR conditions to introduce random point mutations into the AAV capsid gene. | Straightforward approach for developing highly variable AAV capsid libraries | Likelihood of functional diversity is low |
| DNA Family Shuffling | Genetic material from related AAV serotypes is shuffled to create chimeric capsids. |
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| In Silico Design | Computational methods used to predict and design AAV capsid variants. |
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| RNA-seq | DNA-seq | |
|---|---|---|
| Advantages |
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| Limitations |
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