코로나바이러스 S 단백질로 Pseudotype된 렌티바이러스
Lentivirus Pseudotyped with Coronavirus Spike (S) Protein

바이러스가 호스트 세포에 들어가는 첫번째 단계는 세포 표면에 부착하는 것입니다. 이는 바이러스의 특정한 receptor 단백질이 호스트 세포막에 존재하는 상보적인 receptor에 결합함으로써 이루어집니다. 외부 층으로 지질 이중막을 갖는 코로나바이러스 및 렌티바이러스와 같은 외피 보유 (enveloped) 바이러스의 경우, 바이러스 receptor 단백질이 외피에 박혀서 바깥쪽으로 돌출되어 있습니다. 단백질 capsid 외피를 외부 층으로 갖는 아데노바이러스 및 AAV와 같은 외피가 없는 (non-enveloped) 바이러스의 경우 바이러스 receptor는 capsid의 일부로 존재합니다.

코로나바이러스의 경우 spike (S) 단백질은 바이러스 envelope에서 돌출된 spike를 형성하여, 바이러스가 왕관 또는 후광과 같은 모습으로 보이게 하며, 이로부터 코로나바이러스라는 이름이 유래되었습니다. 이 spike는 호스트 세포에 대한 바이러스의 부착을 담당하며, 바이러스 envelope이 호스트 세포막에 융합되어 세포로 바이러스가 유입되도록 합니다.

코로나바이러스는 다양한 호스트 종에 대해 매우 다른 tropism을 나타내는 많은 바이러스들로 구성된 큰 그룹의 바이러스입니다. 따라서 특정한 코로나바이러스 종은 일반적으로 하나 또는 몇 개의 호스트 종만 효과적으로 감염시킬 수 있습니다. 이 tropism은 특정 바이러스 유형의 S 단백질이 호스트 종의 타겟 receptor에 특이적으로 결합하기 때문입니다. 예를 들어, SARS 및 COVID-19의 원인이 되는 바이러스인 SARS-CoV 및 SARS-CoV-2는 S 단백질이 인간 호흡기관, 폐 및 구강 상피세포의 표면에 존재하는 angiotensin converting enzyme 2 (ACE2) receptor와의 결합을 통해 인간을 감염시키게 됩니다. 반면에, MERS의 원인이 되는 MERS-CoV는 dipeptidyl peptidase-4 (DPP4) receptor와의 결합을 통하여 인간 세포로 진입합니다.

코로나바이러스 세포 진입 연구를 위한 pseudotype된 렌티바이러스의 이용

코로나바이러스의 세포 진입 메커니즘과, 바이러스가 한 호스트 종에서 다른 종으로 뛰어넘을 수 있도록 장시간 동안 바이러스 tropism이 어떻게 진화하는지를 이해하려면, 여러 다른 코로나바이러스 종들의  S 단백질들이 호스트 receptor와 어떻게 상호작용하는지를 연구하는 것이 필수적입니다. 그러나 이러한 연구는 특히 biosafety level 3 (BSL-3) 실험실을 필요로 하는 SARS-CoV-2와 같은 위험한 바이러스 균주의 경우 살아있는 코로나바이러스를 생산하고 조작하는 어려움으로 인한 지장이 있습니다.

살아있는 코로나바이러스를 사용하는 것에 대한 대안이 코로나바이러스 S 단백질로 pseudotype된 재조합 렌티바이러스를 사용하는 것입니다. 코로나바이러스처럼 렌티바이러스는 enveloped 바이러스입니다. 재조합 렌티바이러스를 패키징할 때 S 단백질이 바이러스 envelope에 도입될 수 있습니다. 그 결과 생성된 pseudotype된 렌티바이러스는 표면에 표시된 코로나바이러스 S 단백질에 의하여 코로나바이러스 세포 진입 메커니즘을 모방하여 적절한 receptor를 보유한 호스트 세포로 진입할 수 있게 됩니다. 재조합 렌티바이러스는 매우 안전하며, 어떠한 유형의 코로나바이러스 유래의 야생형 또는 돌연변이 S 단백질로도 pseudotype될 수 있습니다.

VectorBuilder는 다양한 코로나바이러스 종의 S 단백질들로 pseudotype된 다양한 렌티바이러스 벡터를 제공합니다. EGFP 또는 luciferase와 같은 다른 리포터를 발현할 수 있는 다양한 벡터를 사용하여, 다양한 방법을 통해 호스트 세포로의 바이러스 진입을 모니터링할 수 있습니다.

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가격 및 소요 시간
Scale Application Minimum Titer Volume Price (USD) Turnaround
Pilot Cell culture >108 TU/ml 250 ul (10x25 ul) $799 8-16 days
Medium 1 ml (10x100 ul) $1,199
Large >109 TU/ml 1 ml (10x100 ul) $1,999
Ultra-purified medium Cell culture & in vivo >109 TU/ml 500 ul (10x50 ul) $2,599
Ultra-purified large 1 ml (10x100 ul) $3,199

TU = Transduction units (also known as infectious unit)

Pseudotyping에 사용되는 렌티바이러스 벡터의 유형

이론적으로 모든 렌티바이러스 벡터가 pseudotype 될 수 있습니다. 편의를 위해 대부분의 용도을 만족시킬 수 있는 표준 벡터 세트를 제공합니다. 아래의 Vector Picker를 사용하여 고객의 목적에 적합한 표준 벡터를 찾을 수 있습니다.

Vector Picker

Pseudotyping에 사용되는 렌티바이러스 벡터의 Map

Vector Picker에서 적합한 벡터를 찾을 수 없는 경우 다음과 같이 맞춤형 렌티바이러스 벡터를 만들 수 있습니다.

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Pseudotyping에 사용되는 Spike (S) 단백질들의 유형

코로나바이러스는 자연에 매우 널리 퍼져 있는 방대한 바이러스들의 그룹으로, 사실상 검사된 거의 모든 포유류와 조류를 감염시킬 수 있습니다. 지금까지 수백 종의 코로나바이러스가 알려졌습니다. 이들 중 수십 종은 인간, 가축, 애완 동물 또는 동물모델을 감염시키거나 이들 바이러스들과 진화적으로 밀접한 관련이 있기 때문에 중요하다고 볼 수 있습니다. 이 중요한 코로나바이러스 종들의 phylogenetic tree는 다음과 같습니다.

중요한 코로나바이러스 종들의 phylogenetic tree

중요한 coronavirus 종에 대한 자세한 정보는 아래 표에 열거되어 있다.

중요한 coronavirus 종들의 리스트

VectorBuilder는 위의 코로나바이러스 종들의 S 단백질에 의해 pseudotype된 렌티바이러스들을 제공합니다. 이외의 S 단백질에 의한 pseudotyping도 요청할 수 있습니다.

SARS-CoV-2 S 단백질을 사용한 pseudotyping을 위하여 아래의 표와 같은 여러 옵션들을 제공합니다.

현재 제공되는
SARS-CoV-2 S 단백질의 변종들

또한 VectorBuilder는 바이러스 envelope 단백질이 없는 bald 렌티바이러스를 제공하며, 이는 negative control로 사용될 수 있습니다.

실험적인 검증

당사에서는 pseudotyping 방법을 최적화하기 위한 다수의 자체적인 기술을 개발했습니다. 그 결과, 당사의 최적화된 바이러스는 기존의 다른 방법들과 비교할 때 훨씬 더 높은 transduction 효율을 나타냅니다. 당사의 바이러스에 대한 광범위한 실험적 검증을 수행했습니다. SARS-CoV-2 S 단백질과 D614G mutation을 가진 SARS-CoV-2 S 단백질로 pseudotype된 렌티바이러스는 인간 ACE2 receptor를 높은 수준으로 발현하는 293T 세포를 효율적으로 transduction할 수 있지만, ACE2 발현이 안되거나 낮은 293T 세포는 transduction할 수 없음을 형광 reporter를 이용하여 보여주고 있습니다 (Figure 1). 따라서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 VSV-G로 pseudotype된 바이러스를 위한 transduction에 최적화된 당사의 ACE2-발현 세포주 사용을 권장합니다.

아래는 transduction test (Figure 1, Figure 2, Figure 3), luciferase (Figure 4) 및 Western blot (Figure 5) 결과입니다.

293T cell line transduced with SARS-CoV-2 S protein

Figure 1. 293T 또는 human ACE2 receptor (hACE2)를 발현하는 293T 세포를 SARS-CoV-2 wildtype (WT), B.1.1.529(omicron) 또는 D614G S 단백질로 pseudotype된 EGFP 발현 렌티바이러스로 형질도입하였습니다. Bald 렌티바이러스를 음성 대조군으로 사용했습니다. 이미지는 형질도입 후 72시간에 촬영되었습니다.

 

293T (hACE2) cells transduced with lentivirus pseudotyped with N439K or N501Y S protein

Figure 2. 293T (hACE2) 세포들을 N439K 또는 N501Y S 단백질로 pseudotype한 렌티바이러스로 transduction한 결과입니다.

 

293T (hACE2) cells transduced with lentivirus pseudotyped with B.1.1.7 or B.1.351 S protein

Figure 3. 293T (hACE2) 세포들을 B.1.1.7 또는 B.1.351 S 단백질로 pseudotype한 렌티바이러스로 transduction한 결과입니다.

 

 

Figure 4. 293T(hACE2) 세포를 SARS-CoV-2 wildtype S 단백질 또는 D614G 변이체 또는 VSV-G 단백질로 pseudotype된 luciferase를 발현하는렌티바이러스로 형질도입하였습니다. Luciferase 분석은 형질도입 후 72시간에 수행되었고, 형질도입되지 않은 세포의 배경 발광을 각 그룹의 발광 값에서 뺍습니다..

 

Figure 5. SARS-CoV-2 S 단백질의 S2 domain에 대한 항체를 사용하여 패키징 세포와 pseudotype된 바이러스에서 full-length 및 절단된 S2 부분이 존재함을 보여주는 western blot 분석 결과. 주: S 단백질은 감염되는 세포에서 바이러스의 도입을 돕기 위하여 S 단백질이 자연적으로 절단됩니다. Lane 1: marker. Lane 2: Transduction을 하지 않은 293T 세포. Lane 3: VSV-G pseudotyping 렌티바이러스 패키징 plasmid들을 transfection한 293T 세포. Lane 4: S 단백질 helper plasmid만 transfection한 293T 세포. Lane 5: S pseudotyping 렌티바이러스 패키징 plasmid 들로 transfection한 293T 세포. Lane 6: VSV-G pseudotype한 렌티바이러스 입자. Lane 7: S pseudotype한 렌티바이러스 입자.

렌티바이러스 pseudotyping 서비스를 이용하려면 어떻게 해야 합니까?

아래 링크를 통해 렌티바이러스 pseudotyping 서비스에 대해 문의하시면 됩니다.

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