Lentivirus Pseudotyped with Coronavirus S Protein

바이러스가 호스트 세포에 들어가는 첫번째 단계는 세포 표면에 부착하는 것이다. 이것은 바이러스의 특정 receptor 단백질이 호스트 세포막의 상보적 receptor에 결합할 때 달성된다. 외부 층으로 lipid bilayer membrane을 갖는 coronavirus 및 lentivirus와 같은 enveloped virus의 경우, 바이러스 receptor protein이 envelope에 박혀서 바깥쪽으로 돌출되어 있다. 단백질 capsid 외피를 외부 층으로 갖는 adenovirus 및 AAV와 같은 non-enveloped virus의 경우 바이러스 receptor는 capsid의 일부이다.

Coronavirus의 경우 spike (S) protein은 바이러스 envelope에서 돌출된 스파이크를 형성하여, 바이러스가 왕관 또는 광환과 같은 모양이 된다. 따라서 coronavirus라는 이름이 붙었다. 이 스파이크는 호스트 세포에 대한 바이러스 부착을 담당하며, 바이러스 envelop이 호스트 세포막에 융합되어 세포로 바이러스가 유입되도록 한다.

Coronavirus는 다양한 호스트 종에 대해 매우 다른 tropism을 나타내는 많은 바이러스 그룹을 구성한다. 따라서 특정 coronavirus 종은 일반적으로 하나 또는 몇 개의 호스트 종만 효과적으로 감염시킬 수 있다. 이 tropism은 특정 바이러스 유형의 S protein이 호스트 종의 표적 receptor에 특이적으로 결합하기 때문이다. 예를 들어, SARS 및 COVID-19의 원인이 되는 바이러스인 SARS-CoV 및 SARS-CoV-2는 S protein이 인간 호흡기관, 폐 및 구강 상피세포의 표면에서 angiotensin converting enzyme 2 (ACE2) receptor에 결합하는 것을 통해 각각 인간을 감염시킨다. 반면, MERS의 원인이 되는 MERS-CoV는 dipeptidyl peptidase-4 (DPP4) receptor에 결합하여 인간 세포로 진입한다.

Using pseudotyped lentivirus to study coronavirus cell entry

Coronavirus의 세포 진입 메커니즘과 바이러스가 한 호스트 종에서 다른 종으로 뛰어넘을 수 있도록 시간이 지남에 따라 바이러스 tropism이 어떻게 진화하는지 이해하려면, 다른 coronavirus 종의  S protein이 호스트 receptor와 어떻게 상호작용하는지 연구하는 것이 중요하다. 그러나 이러한 연구는 특히 biosafety level 3 (BSL-3) 실험실을 필요로 하는 SARS-CoV-2와 같은 위험한 바이러스 균주의 경우 살아있는 coronavirus를 생산하고 조작하는데 어려움으로 인해 방해를 받고 있다.

살아있는 coronavirus를 사용하는 것에 대한 대안으로 coronavirus S protein으로 pseudotype된 재조합 lentivirus 를 사용하는 것이다. Coronavirus와 마찬가지로 lentivirus는 enveloped 바이러스이다. 재조합 lentivirus를 패키징할 때 S protein이 바이러스 envelope에 도입될 수 있다. 그 결과 생성된 pseudotyped lentivirus는 coronavirus에 의한 세포 진입 메커니즘을 모방하여, 이제 표면에 표시된 S protein을 이용하여 적절한 receptor를 보유한 호스트 세포로 진입할 수 있다. 재조합 lentivirus는 안전하며 모든 유형의 coronavirus에서 유래한 야생형 또는 돌연변이 S protein으로 pseudotype될 수 있다.

VectorBuilder는 다양한 coronavirus 종의 S proteins로 pseudotype된 다양한 lentivirus 벡터를 제공한다. EGFP 또는 luciferase와 같은 다양한 리포터를 발현할 수 있는 다양한 벡터를 사용하여, 여러 방법을 통해 호스트 세포로의 바이러스 진입을 모니터링할 수 있다.

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Price and turnaround
Scale Application Minimum Titer Volume Price (USD) Turnaround
Pilot Cell culture >10TU/ml 250 ul (10x25 ul) $599 8-16 days
Medium 1 ml (10x100 ul) $999
Large >10TU/ml 1 ml (10x100 ul) $1,599
Ultra-purified medium Cell culture & in vivo >10TU/ml 500 ul (10x50 ul) $1,999
Ultra-purified large 1 ml (10x100 ul) $2,499

TU = Transduction units (also known as infectious unit)

Types of lentivirus vectors used in pseudotyping

이론적으로 모든 lentivirus 벡터는 pseudotype이 될 수 있다. 편의를 위해 대부분의 응용을 충족시킬 수 있는 표준 벡터 세트를 제공한다. 아래 Vector Picker를 사용하여 자신에게 적합한 표준 벡터를 찾을 수 있다. 아래 Vector Picker를 사용하여 자신에게 적합한 표준 벡터를 찾을 수 있다.

Vector Picker

Map of lentivirus vector used in pseudotyping

Vector Picker에서 적합한 벡터를 찾을 수 없는 경우 다음과 같이 custom lentivirus 벡터를 만들 수 있다.

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Types of spike (S) proteins used in pseudotyping

Coronavirus는 자연에 널리 퍼져 있는 방대한 바이러스 그룹을 구성하며, 사실상 검사된 거의 모든 포유류와 조류를 감염시킨다. 지금까지 수백 종의 coronavirus가 알려졌다. 이들 중 수십 종은 인간, 가축, 애완 동물 또는 동물모델을 감염시키거나 또는 이들과 진화적으로 밀접한 관련이 있기 때문에 중요하다고 볼 수 있다. 이 중요한 coronavirus 종의 phylogenetic tree는 다음과 같다.

Phylogenetic Tree of Important Coronavirus Species

중요한 coronavirus 종에 대한 자세한 정보는 아래 표에 열거되어 있다.

List of important coronavirus species

VectorBuilder는 위의 모든 coronavirus 종의 S protein에 의해 pseudotyped lentivirus를 제공한다. 다른 S protein 공급원에 의한 pseudotyping도 요청할 수 있다.

SARS-CoV-2 S protein을 사용한 pseudotyping을 위해 두 가지 옵션을 제공한다. 기본 옵션은 최초 공개된 SARS-CoV-2 게놈 서열 (GenBank accession: NC_045512.2)의 표준 S protein을 사용한다. 이후 연구에서는 D614G 돌연변이 (GenBank accession: MT628063.1)를 포함하는 새로운 S 변이체가 감염성을 획기적으로 증가시킬 수 있다고 보고했다. D614G 돌연변이를 갖는 바이러스는 전염의 이점으로 인해 전세계 여러 지역에서 빠르게 확산되었다. VectorBuilder는 또한 S의 D614G 변이체로 pseudotype된 lentivirus를 제공하며, 이는 표준 S protein로 pseudotype된 lentivirus보다 더 효율적으로 ACE2 발현 세포를 transduction 할 수 있다.

VectorBuilder는 또한 바이러스 envelope 단백질이 부족한 bald lentivirus를 제공하여 negative control로 사용할 수 있다.

Experimental Validation

당사는 pseudotyping프로토콜을 최적화하기 위해 여러 독점 기술을 개발했다. 당사의 최적화된 바이러스는 일반적인 프로토콜에 비해 훨씬 높은 transduction 효율을 나타낸다. 당사는 바이러스에 대한 광범위한 실험 검증을 수행했다. Fluorescent reporter (Figure 1) 및 luciferase reporter (Figure 2)를 사용하여 그 결과, SARS-CoV-2 S 단백질 및 D614G 돌연변이를 갖는 SARS-CoV-2 S 단백질 pseudotyped lentivirus는 높은 수준의 human ACE2 receptor를 발현하는 293T 세포를 효율적으로 transduction할 수 있지만, ACE2 발현이 없거나 낮은 293T 세포는 그렇지 않음을 보여 주었다. 따라서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 VSV-G pseudotyped virus로 transduction에 최적화된 ACE2-expressing cell line을 사용하는 것을 추천한다.

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다음은 transduction테스트 (Figure 1), luciferase assay (Figure 2) 및 Western blot (Figure 3) 결과이다.

293T cell line transduced with SARS-CoV-2 S protein

Figure 1. Lentivirus pseudotyped with SARS-CoV-2 S protein specifically infected 293T cells overexpressing human ACE2 receptor. Images were taken at 72 hours post-transduction.

 

Figure 2. 293T(hACE2) cells transduced with lentivirus pseudotyped by different envelop protein. Column 1: Untransduced cells. Column 2: SARS-CoV-2 S protein. Column 3: SARS-CoV-2 S protein with D614G mutation. Column 4: VSV-G protein.

        

Figure 3. Western blot analysis using an antibody against the S2 domain of the SARS-CoV-2 S protein revealed the presence of both the full-length and the cleaved S2 portion of S in packaging cells and in pseudotyped virus. Note: the S protein naturally undergoes cleavage to facilitate viral entry into infected cells. Lane 1: marker. Lane 2: Untransduced 293T cells. Lane 3: 293T cells transfected with VSV-G pseudotyping lentivirus packaging plasmids. Lane 4: 293T cells transfected with S protein helper plasmid alone. Lane 5: 293T cells transfected with S pseudotyping lentivirus packaging plasmids. Lane 6: VSV-G pseudotyped lentiviral particles. Lane 7: S pseudotyped lentiviral particles.

How do I obtain lentivirus pseudotyping services?

아래 링크를 통해 lentivirus pseudotyping 서비스에 대해 문의할 수 있다.

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