Coronavirus Vectors

Coronavirus 연구의 중요한 시약은 바이러스 그 자체라는 것이 자명해 보일 수 있다. 하지만 살아있는 coronavirus를 대량으로 생산하는 것은 실제로 말하기는 쉽지만 실행하기는 어렵다. 확실한 접근법은 감염된 개체으로부터 객담과 같은 바이러스를 포함하는 생물학적 샘플을 얻어 바이러스를 대량으로 증식할 수 있는 민감한 세포주에 감염시키는데 사용하는 것이다. 그러나, 살아있는 바이러스를 포함한 샘플을 입수하여 배송하는 것은 쉬운 일이 아니며, 또한 어떤 세포주가 특정 유형의 바이러스 증식을 지원할 수 있는지도 알려져 있지 않다. 또한 객담과 같은 생물학적 샘플은 관심 바이러스 외에도 많은 박테리아, 진균, 바이러스, mycoplasma 오염물질을 운반할 수 있으므로, 적절한 strain이고 정확한 염기서열을 갖는다는 것을 보장하기 위해 배양 바이러스의 완전한 시퀀싱을 포함하여 엄격한 배양과 검증 절차가 필요하다. 중요한 것은 살아있는 바이러스가 세포 배양으로부터 생성되어 완전히 검증될 수 있다고 해도, 다양한 연구에 종종 필요한 것처럼 바이러스 게놈을 더 유전적으로 조작하는 것은 어렵다.

이러한 문제에 대한 최선의 해결책은 reverse genetics 접근법을 사용하여 재조합 벡터에서 살아있는 바이러스를 재구성하는 것이다. 구체적으로는 coronavirus 게놈을 운반하는 이중가닥 DNA 형태의 벡터를 만든 다음, packaging cell에 transfection하여 대량의 살아있는 바이러스를 생산할 수 있다. 이러한 벡터는 리포터 유전자(예: EGFP)를 추가하거나 특정 돌연변이를 도입하는 등 원하는 변경으로 쉽게 수정할 수 있다. 또한 coronavirus가 positive-sense, 단일가닥 RNA 게놈을 가지고 있다는 점을 감안할 때, DNA 기반의 바이러스 벡터는 그 자체로 감염되지 않으며 따라서 최소한의 biosafety 요구사항으로 취급하고 배송하기에 매우 안전하다.

VectorBuilder의 coronavirus 벡터 시스템은 사용자들이 벡터를 적절한 packaging cell에 감염시킴으로써 야생형이나 돌연변이 버전 등 모든 coronavirus 종의 살아있는 바이러스를 재구성할 수 있게 해준다. 그 결과 발생하는 바이러스는 적절한 세포주의 어떤 양으로도 더 증식되고 증폭될 수 있다.

Structure of coronavirus vector
Coronavirus 벡터의 구조는 아래와 같다.

CMV promoter: Human cytomegalovirus immediate early promoter. 패키징 세포에서 downstream 바이러스 RNA 게놈의 높은 수준의 전사를 유도할 수 있다.

T7 promoter: Promoter from T7 bacteriophage. Phage의 T7 RNA polymerase는 이 promoter를 인식하여 고수준의 전사를 촉진한다. Downstream 바이러스 RNA 게놈의 in vitro transcription에 사용할 수 있다.

Coronavirus genome sequence: The complete coronavirus genome sequence (~30 kb, not draw to scale).

Poly(A): String of 25 A residues. 이 영역을 통한 upstream 바이러스 RNA 게놈의 전사는 전사체에 poly(A) tail이 추가되는데, 이는 바이러스 게놈의 적절한 기능에 필요한 것이다.

HDV antigenome ribozyme: Hepatitis delta virus antigenome ribozyme. 이 ribozyme은 전사체에 존재할 때 poly(A)와 ribozyme 사이의 위치에서 전사체의 self-cleavage를 촉매하여 poly(A) tail로 끝나는 전사체를 생성한다.

T7 terminator: Transcriptional termination signal from T7 bacteriophage. T7 RNA polymerase는 이 서열 내에서 전사를 종료한다.

BGH pA: Bovine growth hormone polyadenylation signal. CMV promoter에 의해 구동되는 전사는 이 서열 내에서 종료된다.

당사의 벡터에서 관심있는 coronavirus 게놈 서열은 CMV 및 T7 promoter의 downstream에 삽입된다. 벡터가 packaging cell line에 transfection되면 CMV promoter는 바이러스 게놈의 전사를 유도한다. 바이러스 게놈 서열의 바로 downstream에 있는 Poly (A) 서열은 전사체에 일련의 A 잔기를 추가한다. 전사는 BGH pA까지 계속되며 그곳에서 polyadenylation signal에 의해 종결된다. 전사체에 존재하는 HDV antigenome ribozyme sequence는 poly(A)와 ribozyme 사이의 위치에서 전사체의 self-cleavage를 촉매하여 자연의 바이러스와 유사한 poly(A) tail로 끝나는 전사체를 생성한다. 이 coronavirus 게놈 전사체는 적절한 RNA와 단백질을 만들어낼 수 있으며 이는 살아있는 바이러스 입자의 생산으로 이어질 수 있다.

대체 가능한 바이러스 패키징 방식으로, 이 벡터는 T7 polymerase에 의해 in vitro에서 전사될 수 있으며, T7 promoter에서 전사를 시작하고 T7 terminator에서 끝난다. HDV antigenome ribozyme은 poly(A) sequence 바로 뒤 전사체를 다시 자가 절단한다. 생성된 RNA는 packaging cell에 transfection될 수 있으며, 여기서 적절한 RNA와 단백질을 생산하여 궁극적으로 살아있는 바이러스를 생산할 수 있다.

Types of coronavirus vectors offered

Coronavirus는 자연에 널리 퍼져 있는 방대한 바이러스 그룹을 구성하며, 사실상 검사된 거의 모든 포유류와 조류를 감염시킨다. 지금까지 수백 종의 coronavirus가 알려졌다. 이들 중 수십개 종은 인간, 가축, 애완 동물 또는 동물 모델을 감염시키거나 또는 이들과 진화적으로 밀접한 관련이 있기 때문에 중요하다고 볼 수 있다. 이 중요한 coronavirus 종의 phylogenetic tree는 다음과 같다.

Phylogenetic Tree of Important Coronavirus Species

More detailed information of these important coronavirus species is listed in the table below:

List of important coronavirus species

VectorBuilder는 위의 모든 coronavirus 종에 대한 바이러스 벡터를 제공한다. 다른 종의 벡터 또는 리포터 유전자 또는 특정 돌연변이를 갖는 변형된 벡터도 요청할 수 있다.

How do I order coronavirus vectors?

아래 링크로 coronavirus 벡터에 대해 문의할 수 있다.

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Biosafety considerations

Coronavirus 벡터에서 생성된 살아있는 바이러스는 인간 및/또는 동물에 잠재적으로 감염될 수 있다. 따라서 이들을 작업하려면 적절한 biosafety 표준에 맞는 기관 승인 및 실험실 시설이 필요하다. 다양한 coronavirus 종에 필요한 biosafety 수준에 대한 가이드라인은 ABSA (American Biological Safety Association)에서 발행한 Risk Group Database에서 찾을 수 있다.

VectorBuilder는 요청한 벡터에 따라 벡터에서 생성된 살아있는 바이러스를 처리할 수 있는 사용자의 기관 승인 및 기술적 자격을 평가할 권리를 보유한다. VectorBuilder는 공중 보건 향상을 목표로 하는 연구 활동에만 벡터 사용을 제한하는 material transfer agreement (MTA)을 요구할 수도 있다.