박테리아 게놈 편집 (Bacterial Genome Editing)

Lambda Red recombineering 시스템은 박테리아 게놈 엔지니어링에 널리 사용되는 방법입니다. Lambda bacteriophage에서 유래한 이 시스템은 외래 DNA 단편과 호스트 게놈 간의 homologous recombination을 향상시킵니다. 이 시스템은 homologous recombination을 촉진하기 위해 함께 작용하는 3가지 주요 컴포넌트로 구성됩니다 (Figure 2).

Figure 2. Lambda Red recombineering 시스템의 주요 컴포넌트. 5' to 3' exonuclease인 Exo는 dsDNA (double-stranded DNA)를 처리하고, ssDNA (single-stranded DNA) binding protein인 Beta는 strand annealing을 촉진하고, Gam은 호스트 세포 nuclease가 박테리아 세포 내로 도입된 linear DNA 단편을 분해하는 것을 방지합니다

Lambda Red 유전자는 일반적으로 donor DNA 도입 전에 발현됩니다. 한 가지 방법은 이들 재조합 컴포넌트를 암호화하는 plasmid를 사용하는 것입니다. 또는 lambda Red 유전자가 stable integration된 박테리아 strain이 recombineering에 널리 사용됩니다. 원하는 유전자 변형을 포함하는 donor DNA는 linear dsDNA (double-stranded DNA) 또는 ssDNA (single-stranded DNA) 형태로 박테리아 세포에 도입됩니다. 이 주형에는 항생제 내성 유전자와 같은 선택 마커가 포함되는 경우가 많습니다. Red 단백질 (Exo, Beta, Gam)은 donor DNA와 표적 서열 간의 homologous recombination을 촉진합니다. Recombination 이후, drug selection하고 나서 colony PCR과 같은 selection 방법을 사용하여 의도된 변형을 포함하는 세포를 분리합니다.

CRISPR-Cas9은 박테리아를 포함한 다양한 생물체에 사용되는 게놈 편집 도구입니다. E. coli와 같은 많은 박테리아 종에서 CRISPR-induced DSBs (double-strand breaks)는 NHEJ (non-homologous end joining) repair 경로의 제한된 효율로 인해 치명적입니다. 이러한 특징 덕분에 CRISPR는 추가적인 선택 마커 없이도 강력한 역선택(counterselection) 방법으로 사용될 수 있습니다.

Figure 3. 박테리아에서 point mutation을 생성하기 위한 CRISPR 편집 모식도. Cas9과 recombinases를 암호화하는 plasmid 먼저 박테리아 세포에 도입한 후, lambda Red 단백질 발현을 유도합니다. 이어서, gRNA plasmid와 donor DNA를 Cas9과 recombinases를 발현하는 세포에 도입합니다. 만약 homologous recombination이 실패하면 Cas9에 의해 유도된 DSB로 인해 세포 사멸이 발생합니다(오른쪽). 반대로, donor DNA와 타겟 게놈 서열 사이에 homologous recombination이 일어나 원하는 point mutation이 이루어질 때만 세포가 생존합니다(왼쪽).

Suicide plasmid는 원하는 변형을 포함하는 homologous 서열을 포함하며, 허용 호스트 또는 특정 조건에서만 복제되도록 설계되었습니다. 이는 역선택(counter-selectable) 마커(예: sucrose 민감성을 부여하는 sacB 유전자) 및 조건부 복제 (conditional replication) 시스템(예: temperature-sensitive origins of replication)과 같은 메커니즘을 통해 달성됩니다.

Figure 4. Temperature-sensitive origin of replication을 갖는 suicide plasmid를 이용한 유전자 knockin의 모식도. Homologous recombination은 관심 유전자(GOI)와 선택 마커를 표적 유전자좌 (locus)에 통합시킵니다. 콜로니를 항생제로 선별한 후, plasmid 복제를 방지하기 위해 비허용 온도에서 배양합니다. 2nd recombination 은 안정적인 knockin 또는 원래 게놈으로의 reversion을 초래합니다. 원하는 knockin 콜로니를 선별하여 PCR로 확인하였습니다.

Figure 5. CRISPR-Cas9을 이용한 E. coli 유전자 편집. (A) Lambda Red 단백질 유도와 함께 CRISPR-Cas9 시스템을 이용하여 E. coli 게놈에서 fragment deletion을 생성. (B) 편집되지 않은 세포에서 타겟 영역의 PCR 예상 앰플리콘 사이즈는 약 3,900 bp였지만 (lane 1), CRISPR을 이용한 knockout을 이용한 deletion 결과 앰플리콘 사이즈는 약 1,800 bp (lane 2)로 예상대로 약 2,100 bp deletion이 나타났습니다.