AAV Gene Delivery 솔루션

AAV는 약 4.7 kb 길이의 작은 single-stranded DNA (ssDNA) 게놈으로 구성된 non-enveloped 바이러스로, 단백질 capsid로 둘러싸여 있습니다 (Figure 1B). AAV 게놈은 복제를 위한 비구조 단백질 (Rep78, Rep68, Rep52, Rep40)과 이십면체 capsid를 구성하는 60개 subunits을 형성하는 구조 단백질 (VP1, VP2, VP3)을 포함한 여러 단백질을 암호화합니다. Assembly-activating protein (AAP)과 membrane-associated accessory protein (MAAP)도 게놈 내에 암호화되어 있으며, 각각 capsid 조립과 바이러스 배출을 촉진합니다. 게놈의 양쪽 끝에 있는 inverted terminal repeats (ITR)은 게놈의 복제와 새로운 virion으로의 패키징을 촉진합니다 (Figure 1A).

Figure 1. Wild-type AAV 구조. AAV 게놈 구조 (A) 및 virion 구조 (B).

AAV는 고도로 맞춤화할 수 있으며, ITR 사이에 삽입된 최대 약 4.2 kb 길이의 사용자 정의 DNA 서열로 고유의 ssDNA 게놈을 대체하여 특정 외래유전자를 전달하도록 유전적으로 조작할 수 있습니다 (Figure 2).

Figure 2. 재조합 AAV virion. 재조합 바이러스를 만들기 위해 야생형 바이러스 게놈을, 선택한 promoter에 의해 구동되는 외래유전자로 대체합니다.

AAV를 바이러스 벡터로 활용하는 주요 이점은 자연적으로 발생하는 serotype의 다양성으로 인한 다양한 조직 친화성입니다 (Table 1). 다양한 조직 친화성을 갖는 AAV를 생성하기 위해, capsid 단백질을 교체하여 재조합 바이러스에 다른 serotype을 부여할 수 있습니다 (Figure 2). 또한, 조직 및 세포 특이적 표적화는 Capsid Evolution을 통한 새로운 capsid 변이체 생성 enhancer/promoter 스크리닝을 통한 재조합 바이러스 게놈 내 새로운 regulatory element조작을 통한 유전자 발현 최적화 등 다양한 방법을 통해 더욱 향상될 수 있습니다. 이를 통해 신경과학 연구의 경우 뇌, 안과 응용 분야의 경우 망막과 같이 접근하기 어려운 조직을 표적화할 수 있습니다.

Table 1. 다양한 AAV serotype은 다양한 세포 및 조직 유형을 표적화하는 것을 용이하게 합니다.

Wild-type AAV는 호스트 세포 표면 receptor에 결합하고, clathrin매개 또는 다른 형태의 endocytosis를 통해 세포 내부로 들어갑니다. Endosom 탈출 후, 바이러스는 분해를 위해 proteasome으로 보내지거나, uncoating과 바이러스 게놈 복제를 위해 핵으로 이동합니다. AAV는 dependoparvovirus로서, 바이러스 복제에 필요한 특정 인자들을 제공받기 위해 adenovirus나 herpes simplex virus와 같은 helper virus에 의존합니다. Helper virus가 없으면, AAV는 호스트 내에 잠복 상태로 남아 episomal circular monomer 또는 concatemer로 존재합니다.

재조합 AAV는 wild-type AAV와 유사한 생활 주기를 가지지만, 복제하거나 새로운 virion을 생산할 수 없습니다. 이는 바이러스 단백질을 암호화하는 대신, 선택된 외래유전자를 운반하고 발현시키기 때문입니다 (Figure 3). Single-stranded AAV (ssAAV)의 경우, 바이러스 게놈은 ssDNA이며, 이는 호스트 세포 기구에 의해 double-stranded DNA (dsDNA)로 전환됩니다. 반면, self-complementary AAV (scAAV)는 게놈이 스스로 접혀 dsDNA를 형성하도록 설계되어, 호스트 매개 second-strand DNA synthesis라는 rate-limiting단계를 우회합니다. 이는 효율을 높이지만, 약 4.2 kb에서 2.1 kb로 cargo capacity를 절반으로 줄입니다. 재조합 AAV 게놈은 호스트 세포 핵에 episome 형태로 유지되며, non-dividing 세포에서는 지속되거나, dividing 세포에서는 희석될 수 있습니다. Transcription후, AAV mRNA는 cytoplasm으로 운반되어 translation을 통해 외래유전자 단백질을 생산하거나, RNA는 cytoplasm으로 운반되어 처리 및 조절됩니다 (Figure 3).

Figure 3. 재조합 AAV 생활 주기.

재조합 AAV 생산에는 일반적으로 triple transfection 방법이 사용됩니다. 이 방법은 3가지 plasmid를 co-transfection 시키는 것을 포함합니다. 관심 유전자(GOI)를 암호화하는 transfer plasmid, serotype을 결정하는 replication protein (Rep)과 capsid protein (Cap)을 암호화하는 RepCap plasmid, 그리고 복제에 필수적인 adenoviral factor (E4, E2A, VA)를 암호화하는 helper plasmid입니다. 이러한 plasmid를 HEK293T (E1A/E1B 발현)와 같은 packaging cell line에 transfection 시킨 후, serotype에 따라 cell lysate 또는 supernatant에서 바이러스 입자를 채취합니다. 이후, 바이러스를 농축하고 추가 정제 (예: cesium chloride gradient ultracentrifugation)한 후, 후속 유전자 전달 응용을 위한 품질 검사를 실시합니다.

Figure 4. AAV 패키징을 위한 triple transfection 방법.