CRISPR IVT RNA
CRISPR IVT RNA는 cell-type promoter 발현과 무관한 편집, genome integration 위험이 없고, off-target effect를 줄이는 일시적 발현 등 많은 장점으로 인해 genome editing 방법으로 빠르게 채택되고 있습니다. 또한 Cas9 mRNA와 gRNA는 lipid nanoparticle에 co-encapsulation되어 전달될 수 있어 in vitro 및 in vivo에서 효율적인 유전자 전달 및 편집이 가능합니다. VectorBuilder는 Cas9 mRNA, Cas9-ABE mRNA, guide RNA를 포함한 CRISPR-genome editing을 위한 IVT RNA 제품을 제공합니다. CRISPR 실험을 시작하려면 아래 버튼을 클릭하여 디자인 팀에 문의하세요.
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중점 사항
견고한 품질, 빠른 소요시간 및 경제적인 가격
실험 설계, 데이터 분석 및 문제 해결을 위한 강력한 기술 지원
빠르고 효율적인 편집을 위한 Cas9 mRNA 및 gRNA LNP co-encapsulation
높은 발현 효율의 서열 최적화된 Cas9은 licensing가능
세부 사항
- Premade CRISPR IVT RNA 제품.
- Therapeutic RNA development: IVT 벡터 디자인 & 클로닝, IVT RNA 생산 & 정제.
- LNP encapsulation: 표준 및 커스텀 formulations, antibody-conjugated LNP.
- CDMO services: 공정 개발, GMP 제조, fill/finish.
기술적인 정보
CRISPR IVT RNA는 in vitro 및 in vivo genome editing과 CRISPR-mediated base editing을 포함한 다양한 시스템에 적용될 수 있습니다. 다음 데이터는 다양한 조건에서 CRISPR IVT RNA의 효과를 검증합니다.
- In vitro knockout
- Dual-gRNA knockout
- In vivo knockout
- Base editing
Figure 1. Validation of hSpCas9 mRNA in vitro. (A) IVT Cas9 mRNA was transfected into HEK293T-EGFP cells with two types of EGFP-targeting gRNA. EGFP expression in non-treated (NC) and transfected cells was observed by microscopy (B) and quantified using flow cytometry (C, D). (E, F) The editing to EGFP genes on the genome was further confirmed by T7E1 assay and Sanger sequencing.
Figure 2. Validation of hSpCas9 mRNA knockout with dual gRNAs. (A) A vector coding for Cas9 was linearized and subjected to in vitro transcription to produce Cas9 mRNA. The Cas9 mRNA was then co-transfected with two gRNAs targeting the same gene. (B) Detailed experimental design of the gRNAs targeting exons 2-4 of the gene of interest. Primer pairs P1 and P2 were designed for PCR validation to amplify the regions surrounding the target sites. (C) Gel electrophoresis of PCR amplified genomic DNA confirms gene editing.
Figure 3. In vivo CRISPR IVT RNA knockout. (A) Experimental timeline of CRISPR IVT RNA knockout in vivo. Mice were intravenously injected with 3.0 ug/g of Cas9 mRNA/gRNA mixture co-encapsulated in LNPs or PBS. On Day 7, liver genomic DNA was extracted, PCR amplified, and subjected to a T7E1 assay to confirm editing. (B) Gel electrophoresis of the T7E1 assay confirming editing (asterisked ban). Each lane represents one biological replicate.
Figure 4. Validation of adenine base editor (ABE) mRNAs in vitro. mRNAs coding for (A) ABE8.20-m and (B) ABE7.10 were co-transfected with identical gRNAs to HEK293T cells. Genomic DNA was extracted 48 hr post-transfection, and the target region was amplified by PCR and subjected to NGS. A to G editing (asterisks) was detected within the editing windows (dashed box). The highest editing rates of 97.7% (A) and 95.6% (B) were achieved on the 5th nucleotide.
HiExpress™ hSpCas9 IVT mRNA
VectorBuilder는 다른 human codon-optimized Cas9 variants에 비해 발현이 증가한 서열 최적화된 HiExpressTM hSpCas9 IVT mRNA를 개발했으며, 세포에서 비슷한 편집 효율성을 달성하는데 필요한 mRNA 양이 적어 치료 및 생명공학 응용 분야의 유전자 편집에 이상적입니다. 이 제품 라이선스에 대한 자세한 내용은 문의 주시기 바랍니다.
Figure 5. HiExpress™ hSpCas9 IVT mRNA developed by VectorBuilder has high expression and editing efficiency. (A) Western blot analysis and (B) quantification of normalized Cas9 expression relative to hSpCas9 in HEK293T cells 24 hours post-transfection with 1 ug of either hSpCas9 IVT mRNA, codon-optimized HiExpress™ hSpCas9 IVT mRNA, or a non-treated control (NC). (C) T7E1 editing assay in HEK293T cells 24 hours post-transfection with 1 ug of gRNA and the indicated amounts of hSpCas9 or HiExpress™ hSpCas9 IVT mRNA. The blue star indicates the intact PCR amplicon and the pink arrows indicate the fragments generated by T7E1.
FAQ
CRISPR-Cas9은 plasmid, 재조합 바이러스, gRNA-Cas9 RNP 복합체, gRNA와 Cas9 IVT mRNA의 혼합물을 포함한 다양한 방법을 통해 전달될 수 있습니다. 이러한 각 방법에는 고유한 장점과 한계가 있어 연구자는 최소의 off-target effect로 최대의 효율을 위해 실험 목적에 적합한 방법을 선택할 수 있으며, IVT RNA는 가장 유망한 접근 방식 중 하나로 빠르게 부상하고 있습니다.
Plasmids는 일반적으로 대량으로 저렴하게 생산하기 가장 쉽고, chemical transfection 및 electroporation을 통해 쉽게 전달할 수 있습니다. 그러나 이러한 전달 방법 때문에 in vitro 응용에 크게 제한됩니다. 또한 plasmid transfection의 효율성은 세포 유형 간에 크게 다를 수 있으며, 발현은 cell-type specific promoter 활성에 따라 달라지므로 특정 시스템에서는 효율성을 방해할 수 있습니다. 결과적으로 plasmid는 Cas9의 높은 발현 수준으로 이어질 수 있는 고활성 프로모터를 사용하는 경향이 있으며, 이는 off-target editing과 plasmid DNA의 숙주 게놈으로의 무작위 integration을 증가시킬 수 있습니다.
Recombinant viruses는 CRISPR-Cas9을 전달하는 또 다른 인기 있는 방법인 경향이 있는데, 이는 transfection이 어려운 세포에서 사용할 수 있고 여러 gRNA 실험을 위해 안정적으로 발현되는 Cas9 세포주를 만드는데 사용할 수 있기 때문입니다. 그러나 이 시스템은 cell-type dependent promoter 특이성과 장기간 Cas9 발현으로 인한 off-target effect의 위험 증가를 포함하여 plasmid 전달과 동일한 많은 제한 사항이 있습니다. 또한 재조합 바이러스는 특히 Cas9 transgene의 게놈 integration이 발생하는 retrovirus 및 lentivirus 시스템에서 insertional mutagenesis의 위험이 높습니다.
gRNA-Cas9 RNP 복합체로 전달하면 plasmid와 재조합 바이러스 시스템의 많은 제한 사항을 우회하여 전사나 번역이 필요하지 않으므로 빠른 편집이 가능합니다. 그러나 이 방법은 효율적인 전달을 위해 electroporation이 필요하기 때문에 in vitro 적용으로 크게 제한됩니다. 이 방법에 의한 편집은 빠르게 일어나고, Cas9이 호스트 세포에서 분해되면서 빠르게 중단되므로 Cas9 protein의 가용성에 따라 크게 제한됩니다.
위의 방법과 달리 gRNA와 Cas9 IVT mRNA의 혼합물을 전달하는 것은 최소한의 off-target effect로 genome editing을 위한 가장 효율적인 방법 중 하나로 빠르게 부상했습니다. gRNA와 Cas9 IVT mRNA는 lipid nanoparticle로 co-encapsulation하거나 또는 chemical transfection 시약으로 함께 전달될 수 있으므로 이 시스템은 genome integration 의 위험 없이 in vitro 및 in vivo 적용에 모두 적합합니다. 또한 전사가 필요하지 않아 발현이 cell-type specific promoter 활성과 무관하게 이루어지고, 번역이 비교적 빠르게 발생하여 빠르고 효율적인 편집이 가능합니다. gRNA-Cas9 RNP 복합체와 비교했을 때 mRNA는 Cas9의 장기간 발현을 촉진하여 지속적인 수준의 편집이 가능하지만, mRNA는 결국 분해되고 편집은 일시적으로만 발생하여 off-target effect가 제한됩니다.
요약하자면, plasmid, 재조합 바이러스, gRNA-Cas9 RNP 복합체 방법을 통한 CRISPR-Cas9 구성요소의 전달에는 여러 응용 분야에 제한이 있으며, 효율성 제한, off-target effect 위험 증가, insertional mutagenesis 가능성 등의 단점이 있습니다. 또한, gRNA와 Cas9 IVT mRNA의 혼합물을 전달하는 것은 수많은 장점과 적은 제한으로 인해 가장 효율적인 게놈 편집 방법 중 하나이며, 게놈 편집 응용에 고려되어야 합니다.
CRISPR-mediated genome editing의 경우 Cas9 nuclease는 게놈의 site-specific guide RNA (gRNA)의 표적 부위로 이동하여 DNA 절단을 생성합니다. 대부분의 경우, 간단한 유전자 knockout을 생성하기 위해 single gRNA를 Cas9와 함께 사용하여 double-strand break (DSB)를 생성할 수 있으며, 이는 non-homologous end joining (NHEJ)에 의해 비효율적으로 복구되어 복구 부위에서 작은 insertion 또는 deletion과 같은 영구적인 돌연변이가 발생합니다. 이러한 돌연변이는 frameshift, premature stop codon 등으로 인해 관심 유전자의 기능 상실을 초래합니다.
Dual gRNAs는 Cas9_D10A nickase를 사용하여 단일 표적 부위의 두 반대 가닥을 타겟팅하는 경우 사용할 수 있습니다. 이 방법에서 nickase 효소는 두 가닥 모두에서 단일 가닥 절단을 생성하며, 두 gRNA 각각에 의해 가이드되어 표적 부위에 DSB가 발생합니다. 일반적으로 이 방법은 DSB가 생성되려면 두 gRNA 모두에 의한 타겟팅이 필요하기 때문에 CRISPR/Cas9 발현의 off-target effect를 줄입니다.
Cas9_D10A nickase와 외인성 donor DNA template을 사용하여 관심 유전자에 특정 base-change (예: knockin)를 도입하는 경우에도 dual gRNA를 사용할 수 있습니다. 이 접근 방식에서 두 개의 반대 가닥은 원하는 돌연변이 부위에 급접한 두 부위에서 두 gRNA에 의해 표적화되고, homology-directed repair (HDR) 경로는 외인성 donor template을 사용하여 절제된 서열을 복구합니다.
주요 인용 논문
Phase Separation Enhanced PROTAC for Highly Efficient Protein Degradation
Yu, et al.
Biomacromolecules, 2024, doi: 10.1021/acs.biomac.4c00424
Products used:
Abstract: Biomacromolecular condensates formed via phase separation establish compartments for the enrichment of specific compositions, which is also used as a biological tool to enhance molecule condensation, thereby increasing the efficiency of biological processes. Proteolysis-targeting chimeras (PROTACs) have been developed as powerful tools for targeted protein degradation in cells, offering a promising approach for therapies for different diseases. Herein, we introduce an intrinsically disordered region in the PROTAC (denoted PSETAC), which led to the formation of droplets of target proteins in the cells and increased degradation efficiency compared with PROTAC without phase separation. Further, using a nucleus targeting intrinsically disordered domain, the PSETAC was able to target and degrade nuclear-located proteins. Finally, we demonstrated intracellular delivery of PSETAC using lipid nanoparticle-encapsulated mRNA (mRNA-LNP) for the degradation of the endogenous target protein. This study established the PSETAC mRNA-LNP method as a potentially translatable, safe therapeutic strategy for the development of clinical applications based on PROTAC.
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