RNA & LNP 생산

Figure 4. Translation 효율 증대를 위한 IVT mRNA의 UTR 최적화. In vitro에서 Gaussia luciferase 발현을 조절하는 다양한 5' 및 3' UTR 조합을 테스트하였습니다. HEK293T 세포를 12-well 플레이트에 well당 2.3x105 세포 밀도로 접종하였습니다. 각 well에 1 μg의 mRNA를 transfection 하였습니다. Transfection 후 6 h, 24 h, 48 h, 72 h 및 96 h 에 세포 배양액에서 Gaussia luciferase 활성을 측정하였습니다.

Try our HiExpress™ Gaussia Luciferase IVT mRNA 

Figure 5. 3' UTR에 miR-122 타겟 사이트 도입을 통한 간 특이적 유전자 발현 감소. 마우스에 HiExpress™ Firefly Luciferase를 코딩하는 LNP-mRNA 10 μg을 3' UTR에 miR-122 타겟 사이트를 포함하거나 포함하지 않고 정맥 주사하였습니다. miR-122 타겟 사이트의 위치를 달리한 두 가지 구성 (design A + B)에 대해 테스트하였습니다. 주사 후 6시간에 마우스를 희생시켜 장기를 적출하고, luminescence를 측정하였습다. miR-122는 간에서 특이적으로 높게 발현되는 특징이 있어, miR-122 타겟 사이트가 도입된 경우 간 조직에서 luciferase 발현이 감소되는 결과가 나타났습니다.

Try our HiExpress™ Firefly Luciferase IVT mRNA 

Figure 6. IVT mRNA의 코돈 최적화를 통해 in vitro 및 in vivo에서 유전자 발현 향상. (A) IVT mRNA를 이용한 HEK293T 세포에서 HiExpress™ Firefly Luciferase 및 기타 luciferase 의 발현. 12-well 플레이트에서 배양된 세포에 well당 0.5 μg의 mRNA를 transfection하고, transfection 후 6 h, 24 h, 48 h 및 72 h에 luciferase 활성을 측정하였습니다. (B) 성체 C57BL/6 마우스에 30 μg의 LNP-mRNA를 근육 주사한 후 6 h, 24 h 및 48 h에 luciferase 활성을 측정하였습니다. FLuc WT는 wild-type firefly luciferase, FLuc WT(co)는 코돈 최적화된 wild-type firefly luciferase, FLuc2는 Luc2 firefly luciferase를 나타냅니다.

Try our HiExpress™ Firefly Luciferase IVT mRNA 

Try our HiExpress™ Firefly Luciferase LNP-mRNA 

Figure 7. PolyA tail 사이즈 분석. Ribonuclease T1을 사용하여 IVT mRNA에서 PolyA tail을 절단하고, oligo dT affinity chromatography로 분리했습니다. (A) 분리된 polyA tail을 Urea -PAGE 겔 전기영동으로 분석했습니다. (B) 분리된 polyA tail을 LC-MS로 분석했습니다. 예상 사이즈가 120 nt인 polyA tail 120 pmol을 사용하여 디컨볼루션 스펙트럼을 생성했습니다. (C) 예상 사이즈가 120 nt인 polyA tail의 사이즈 분포. 오차 막대(Error bars)는 3회 반복 실험(Triplicates)의 표준 편차를 나타내며, 측정된 가중 평균 길이(Weighted average length)는 123 nt 입니다.

Figure 8. PolyA 길이 및 구조가 translation 효율에 미치는 영향. 동일한 Cap1 및 UTR을 가지지만 polyA tail 길이가 다른 IVT EGFP mRNA를 HEK293T 세포에 transfection 하였습니다.

Figure 9. Modified nucleotide를 통한 유전자 발현 증가 및 dsRNA 불순물 감소. (A) HEK293T 세포에서 firefly luciferase 발현. Modified nucleotide인 N1-Methylpseudouridine (m1Ψ)와 5-Methylcytosine (m5C)의 포함 유무를 달리하여 mRNA를 합성하였습니다. 는 첨가하거나 첨가하지 않고 생성하였다. 세포를 12-well 플레이트에서 배양된 세포에 well당 1 μg의 mRNA를 transfection 하였습니다. Transfection 후 6 h, 24 h, 48 h에 HEK293T 세포의 luciferase 활성을 측정하였습니다. 오차 막대 (Error bars)는 표준 편차를 나타냅니다. (B) Nucleotide modification (m1Ψ) 유무를 달리하여 magnetic bead로 정제한 EGFP IVT mRNA를 동일한 양 (dot 당 750 ng)으로 사용하여 dot blot 분석으로 dsRNA 불순물을 평가하였습니다.

Try our HiExpress^TM Firefly Luciferase IVT mRNA 

Figure 10. Denaturing agarose gel 결과 10,000 nt 이상의 IVT RNA가 높은 온전성 (integrity )을 보임. 

Figure 11. LC-MS로 분석한 IVT mRNA capping 효율. (A) Co-transcription 또는 (B) 효소 방식을 통해 고효율 capping을 달성할 수 있습니다.

dsRNA (Double-stranded RNA)는 IVT의 부산물이며 원치 않는 면역원성을 유발하는 주요 요인입니다. Dot blot 결과 dsRNA 함량을 매우 낮게 하기 위한 초고순도 정제를 위해서는 추가 정제 단계 (예: IP-PR)가 필요할 수 있음을 보여줍니다.

Figure 12. 다양한 정제 공정에 따른 dsRNA 제거 효율. 각기 다른 공정으로 정제된 hSpCas9 IVT mRNA를 동일한 양 (dot 당 1500 ng)으로 사용하여 dot blot 분석을 통해 dsRNA 불순물을 측정하였습니다. 약어: HIC, Hydrophobic interaction chromatography; IP-RP, Ion-pair reversed-phase liquid chromatography.

Figure 13. 다양한 농도의 RNase A를 처리한 후 전구체 (precursor) EGFP RNA와 circular EGFP RNA (circRNA-EGFP)의 겔 전기영동 분석 결과. RNase A는 모든 linear RNA를 분해하지만 circular RNA는 분해하지 않습니다.

Figure 14. LNP-mRNA의 극저온 전자현미경 (cryo-TEM) 사진. Scale bar=100 nm. 

Figure 15. 입자 사이즈 및 제타 전위 (Zeta potential) 분포 분석. PDI (A)와 제타 전위 (B)는 입자의 움직임에 의해 발생하는 빛의 강도 변동 (intensity difference)을 측정하는 DLS을 사용하여 분석하였습니다. 데이터는 LNP 혼합물이 균일함을 보여줍니다.

Figure 16. Anti-CD31 antibody-conjugated LNP-mRNA의 장기간 (153일) 동결보존. (A) Firefly luciferase (FLuc)를 발현하는 LNP-encapsulated mRNA를 두 가지 조건, 즉 첨가제 없이 4°C에서 보관한 경우와 7.5% sucrose 용액에 넣어 -80°C에서 보존하였습니다. 두 그룹의 입자 사이즈 (분홍색 막대)와 PDI (청록색 점)를 초기 값 (original parameters)과 비교하였습니다. (B) 주사 후 6시간에 FLuc mRNA 발현 이미지. 암컷 ICR 마우스에 PBS, 첨가제 없이 4°C에서 보관한 LNP, 또는 7.5% sucrose 용액에 넣어 -80°C에서 보관한 LNP를 정맥 주사하였습니다. (C) 동결보존 후 LNP-mRNA의 encapsulation 효율. 새로 제조한 FLuc LNP-mRNA를 대조군으로 사용하였습니다. (D) 동결보존 후 RNA 온전성 (integrity) 비교. 종합적으로, 본 데이타는 antibody-conjugated LNP-mRNA를 7.5% sucrose 용액에 넣어 -80°C에서 보관하는 것이 장기간 보존 시 입자의 균일성 (homogeneity), encapsulation 효율, 그리고 mRNA 발현을 효과적으로 유지하는 것을 보여줍니다.

Figure 18. LNP를 이용한 효율적인 in vitro mRNA 전달. 세포에 LNP-encapsulated EGFP mRNA 또는 상용 transfection 시약과 혼합된 EGFP mRNA를 transfection하였습니다. (A) Jurkat 및 HEK293T 세포에서 EGFP 발현을 flow cytometry로 확인한 결과 및 (B) transfection후 24시간에 HEK293T 세포의 형광 이미지. MFI: median fluorescence intensity.