Tet Regulatory Protein Expression Cell Lines
VectorBuilder는 단일 클론에서 유래한 Tet regulatory protein-expressing cell line을 제공하며, inducible 유전자 발현 시스템 제작의 일관성과 효율성을 제공합니다. TRE 또는 TRE3G와 같은 inducible promoter에 의해 유도되는 표적 유전자는 바이러스나 plasmid를 사용하여 premade 세포에 도입될 수 있으며, 이를 통해 유연한 실험 설계와 신뢰할 수 있는 유전자 발현 유도가 가능합니다.
주문 정보 Price Match
배송 및 보관
세포는 드라이아이스 (in 10% DMSO-containing culture medium)에 담겨 배송됩니다. 수령 즉시 장기 보관을 위해 cryovial을 액체질소 증기상 (Vapor Phase)에 옮겨 보관하십시오. 단기 보관 (1주일 이내)을 위해 -80°C에서 보관할 수도 있습니다.
기술적인 정보
Figure 1. VectorBuilder의 tTS/rtTA-expressing stable cell line을 사용한 워크플로우.
Tet-inducible 유전자 발현을 달성하려면 VectorBuilder의 premade tTS/rtTA expression cell에 TRE 유도 GOI 발현 plasmid 또는 바이러스를 transfection 또는 transduction 하면 됩니다. GOI의 inducible 발현은 적절한 농도의 doxycycline또는 tetracycline으로 유도한 후, RT-qPCR, Western blot또는 형광 이미징과 같은 적절한 분석을 통해 평가할 수 있습니다.
자세한 내용은 VectorBuilder의 유전자 유도 발현 솔루션 및 Tet-Inducible Gene Expression Vector System 사용 설명서를 참조하십시오. Tet regulatory protein expression cell line에 사용할 inducible GOI 발현용 커스텀 plasmid를 디자인하려면 Vector Design Studio에서 직접 벡터 디자인하거나 디자인 서포트 의뢰하기로 문의해 주십시오.
실험에 의한 검증
Figure 2. tTS/rtTA-expressing HEK293 cell의 검증. 세포에 TRE 유도 EGFP 발현 렌티바이러스를 transduction한 후 antibiotic selection을 수행하였습니다. EGFP 발현은 2 µg/ml doxycycline (Dox)(+ Dox) 또는 doxycycline 무첨가 (- Dox)로 유도 48시간 후 형광 이미징을 통해 평가하였습니다. 배율: 100배.
자료
주요 인용 논문
A lysine-rich cluster in the N-BAR domain of ARF GTPase-activating protein ASAP1 is necessary for binding and bundling actin filaments
Anjelika Gasilina, et al.
J Biol Chem, 2022, doi: 10.1016/j.jbc.2022.101700
Products used:
Abstract: Actin filament maintenance is critical for both normal cell homeostasis and events associated with malignant transformation. The ADP-ribosylation factor GTPase-activating protein ASAP1 regulates the dynamics of filamentous actin-based structures, including stress fibers, focal adhesions, and circular dorsal ruffles. Here, we have examined the molecular basis for ASAP1 association with actin. Using a combination of structural modeling, mutagenesis, and in vitro and cell-based assays, we identify a putative-binding interface between the N-Bin-Amphiphysin-Rvs (BAR) domain of ASAP1 and actin filaments. We found that neutralization of charges and charge reversal at positions 75, 76, and 79 of ASAP1 reduced the binding of ASAP1 BAR-pleckstrin homology tandem to actin filaments and abrogated actin bundle formation in vitro. In addition, overexpression of actin-binding defective ASAP1 BAR-pleckstrin homology [K75, K76, K79] mutants prevented cellular actin remodeling in U2OS cells. Exogenous expression of [K75E, K76E, K79E] mutant of full-length ASAP1 did not rescue the reduction of cellular actin fibers consequent to knockdown of endogenous ASAP1. Taken together, our results support the hypothesis that the lysine-rich cluster in the N-BAR domain of ASAP1 is important for regulating actin filament organization.
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The KU-PARP14 axis differentially regulates DNA resection at stalled replication forks by MRE11 and EXO1
Ashna Dhoonmoon, Claudia M. Nicolae & George-Lucian Moldovan.
Nature Communications, 2022, doi: 10.1038/s41467-022-32756-5
Products used:
Abstract: Suppression of nascent DNA degradation has emerged as an essential role of the BRCA pathway in genome protection.In BRCA-deficient cells, the MRE11 nuclease is responsible for both resection of reversed replication forks, and accumulation of single stranded DNA gaps behind forks. Here, we show that the mono-ADP-ribosyltransferase PARP14 is a critical co-factor of MRE11. PARP14 is recruited to nascent DNA upon replication stress in BRCA-deficient cells, and through its catalytic activity, mediates the engagement of MRE11. Loss or inhibition of PARP14 suppresses MRE11-mediated fork degradation and gap accumulation, and promotes genome stability and chemoresistance of BRCA-deficient cells. Moreover, we show that the KU complex binds reversed forks and protects them against EXO1-catalyzed degradation. KU recruits the PARP14-MRE11 complex, which initiates partial resection to release KU and allow long-range resection by EXO1. Our work identifies a multistep process of nascent DNA processing at stalled replication forks in BRCA-deficient cells.
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Premade stable cell line은 mixed pools또는 single clone에서 유래한 것인가요?
VectorBuilder의 모든 Premade stable cell line은 일관성과 재현성을 보장하기 위해 단일 클론에서 유래합니다. VectorBuilder의 단일 클론 안정 세포주는 엄격한 품질관리 및 기능 검증을 거쳐 다운스트림 연구에 대한 확신을 제공합니다.
Tet Regulatory Protein Expression Cell Line에서 관심 유전자를 유도하기 위해 어떤 inducible promoter를 사용해야 합니까?
적합한 inducible promoter는 세포주에서 발현되는 특정 Tet regulatory protein에 따라 달라집니다. 세포주가 tTS/rtTA (2nd generation)를 발현하는 경우, 관심 유전자는 TRE promoter에 의해 유도되어야 합니다. 세포가 Tet3G (3rd generation)를 발현하는 경우, 유전자는 TRE3G promoter아래에 위치해야 합니다. TRE3G promoter는 tetracycline 또는 그 유사체 (예: doxycycline) 존재 하에 Tet3G에 의해 특이적으로 활성화됩니다. 올바른 promoter를 사용하면 Tet 기반 시스템에서 유전자 발현을 적절하게 유도할 수 있습니다. 자세한 내용은 Mammalian Inducible Promoters 페이지를 참조하십시오. 적합한 inducible 발현 벡터를 디자인하려면 Vector Design Studio에서 직접 벡터 디자인하거나 디자인 서포트 의뢰하기로 문의해 주십시오.