CRISPR IVT mRNA
CRISPR 매개 유전자 편집은 유전체의 표적 부위에 빠르고 효율적으로 돌연변이를 생성할 수 있는 널리 사용되는 기술입니다. VectorBuilder는 높은 in vitro 발현을 보장하는 검증된 CRISPR mRNA 제품을 제공합니다.
주문 정보 Price Match
HiExpress™ hSpCas9
hSpCas9
HiExpress™ ABE mRNA
VectorBuilder의 코돈 최적화 (codon-optimized)된 HiExpress™ hSpCas9 IVT mRNA는 In vitro에서 일관되고 높은 발현을 보장하며, 면역원성 (immunogenicity)을 감소시키기 위한 m1Ψ modification 옵션도 제공합니다.
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VectorBuilder의 hSpCas9 IVT mRNA는 변형된 뉴클레오티드인 N1-Methylpseudouridine (m1Ψ)을 포함하거나 또는 포함하지 않고 주문할 수 있으며, 유전자 편집 기능은 배양 세포에서 기능적으로 검증되었습니다.
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ABE (adenine base editor)는 CRISPR/Cas9과 adenine deaminase에서 유래한 차세대 유전자 편집 도구입니다. ABE7.10을 기반으로 코돈 최적화된 HiExpress™ ABE IVT mRNA는 in vitro에서 높은 발현을 보장하도록 설계되었습니다.
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배송 및 보관
IVT mRNA 제품은 1 mM sodium citrate buffer (pH 6.4)에 저장되며, -80°C에 12개월간 보관할 수 있습니다. 제품은 드라이아이스로 배송되며, 동결-해동 반복을 피하시기 바랍니다.
실험에 의한 검증
- HiExpress™ hSpCas9
- hSpCas9
- HiExpress™ ABE mRNA
Figure 2. VectorBuilder에서 개발한 HiExpress™ hSpCas9 IVT mRNA는 높은 발현 및 편집 효율을 보입니다. 1 ug의 hSpCas9 IVT mRNA, 코돈 최적화된 HiExpress™ hSpCas9 IVT mRNA 또는 무처리 대조군(NC)으로 transfection 24시간 후 HEK293T 세포에서 hSpCas9 대비 normalized Cas9 발현을 (A) Western blot분석 및 (B) 정량화한 결과입니다. (C) 1 ug의 gRNA와 표시된 양의 hSpCas9 또는 HiExpress™ hSpCas9 IVT mRNA로 transfection 24시간 후 HEK293T 세포에서 T7E1 editing assay 결과입니다. 파란색 별은 온전한 PCR 앰플리콘을, 분홍색 화살표는 T7E1에 의해 생성된 단편을 나타냅니다.
Figure 3. In vitro gene editing using Cas9 mRNA (A) IVT Cas9 mRNA는 modified nucleotide인 N1-Methylpseudouridine(m1Ψ)으로 생산되었으며 두가지 유형의 EGFP 표적 gRNA로 293T-EGFP 세포에 transfection 하였습니다. Non-treated (NC) 및 transfection된 세포에서의 EGFP 발현을 현미경(100X)(B)으로 관찰하고 flow cytometry(C)로 정량화하였습니다. (D) Transfection 48시간 또는 72시간 후, EGFP 발현은 non-treated 293T-EGFP 세포의 약 40%로 감소하였습니다. (E 및 F) 게놈 상의 EGFP 유전자에 대한 편집은 T7E1 assay(E) 및 Sanger 시퀀싱(F)에 의해 추가로 확인하였습니다. 강조 표시된 adenine은 유전자 편집으로 서열에 삽입되었음을 나타냅니다.
Figure 4. HiExpress™ ABE7.10 mRNA의 in vitro 검증. 오리지날 mRNA와 HiExpress™ ABE7.10 mRNA를 동일한 gRNA와 함께 HEK293T 세포에 co-transfection 시켰습니다. Transfection 48시간 후 게놈 DNA를 추출하고, 타겟 영역을 PCR로 증폭하여 NGS 분석을 수행하였습니다. 편집 영역 (점선 상자) 내에서 A에서 G로 편집(별표)이 검출되었습니다. HiExpress™ ABE7.10 mRNA는 5번째 뉴클레오타이드에서 97.7%의 편집률을 달성하여 오리지날 mRNA의 30.1%를 크게 상회했습니다.
